PCR-DGGE技术可直接从样品中提取细菌的 DNA或RNA来表征微生物种群，克服了传统微生物群落结构分析方法的 不足[5，6]，并且能够检测识别出不可培养的 细菌，对细菌生态学的 发展起到了巨大的 推动作用[7]，已经成为对微生物群落结构进行多样性分析的 主要生物学方法[8]。根据实验所测得的 不同污泥负荷冲击条件下微生物群落结构和优势菌种来调节工艺运行参数，这对优化活性污泥系统运行､提高污水处理效果等都具有十分重要的 实际应用价值和理论探索意义。
为了进一步研究Ns对活性污泥微生物的 影响。实验（experiment)以碳源作为限制条件，以某高校MBR内的 污泥作为种泥，以SBR作为小试处理工艺，以某高校游泳馆污水为处理对象，综合运用PCR-DGGE技术，试讨论在不同Ns条件下活性污泥中氨氧化菌群落结构的 演替及其多样性的 变化情况，以期进一步了解(Find out)Ns与活性污泥微生物群落结构和生物多样性的 内在联系。
1 材料(Material)与方法
1：1 实验装置与运行条件
实验（experiment)采用自行设计如1所示的 间歇进水序批式反应器，反应器的 主体以有机玻璃制成，长112mm､宽106 mm､高500 mm，设计水面高度400mm，其有效容积为4L。反应器中间采用有机玻璃隔板，隔板的 上端距水面为约为50mm，下端为高度40mm左右的 过水通道。采用隔板将反应器主体分割成体积比为6∶4的 曝气区和非曝气区。非曝气区通过设置可控温度加热器维持水温恒定。在曝气区内采用微孔曝气，为微生物生长提供所需的 溶合氧，同时达到泥水混合的 效果。
实验以某高校MBR反应池内活性污泥作为接种污泥，培养驯化25d使其恢复活性并具有良好的 沉降性。
实验用水为某高校游泳馆的 污水和投加的 葡萄糖。通过投加葡萄糖来调整进水有机物浓度以达到预期的 实验要求。通过反应器的 进水有机物浓度与曝气､沉淀､排水的 时间来对污泥负荷进行调整。污泥负荷冲击采用超负荷法[9]，即对每一负荷阶段，当反应器系统运行稳定并取样分析之后，提高污泥负荷进行下一次冲击。传统活性污泥法系统设计的 典型Ns为0：2~0：5kgBOD5/;具有脱氮功能时一般选择较低的 Ns为0：05~0：15kgBOD5/;延时曝气氧化沟处理(chǔ lǐ)系统的 Ns更低为0：03~0：08kgBOD5/，高负荷活性污泥法Ns为1：5~3kgBOD5/[10]，因此本实验将污泥负荷阶段分为三大阶段，共7个污泥负荷冲击过程进行，各冲击负荷阶段的 运行参数见表1。污泥负荷冲击2d后立刻取样，用于后续PCR-DGGE分析。
1：2 污泥样品基因组DNA的 提取与纯化
1：2：1 样品预处理
将8mL污泥混合液加入至10mL灭菌离心管中，在3000×g下离心4min，弃去上清液。石英砂污水处理被广泛应用于建筑、农业、交通、能源、石化、环保、城市景观、医疗、餐饮等各个领域，也越来越多地走进寻常百姓的日常生活。用灭菌蒸馏水清洗一次，同样的 条件下离心4min，弃去上清液。得到的 污泥样品可用于DNA的 提取。
1：2：2 基因组DNA的 提取
基因组DNA的 提取采用化学裂解-酚\氯仿\异戊醇抽提-试剂盒纯化的 方法，具体步骤见参考文献[9]。
1：3 氨氧化菌（fungus)的 NestedPCR扩增
氨氧化菌的 NestedPCR扩增技术需经过2轮的 PCR扩增，第1轮以总DNA为模板使用氨氧化菌的 特定目标引物和相应的 PCR反应程序对氨氧化菌进行针对性扩增;第2轮以第1轮PCR扩增产物为模板用通用引物F357-GC和R518与PCR反应程序进行扩增。氨氧化菌的 特异性引物对为上游引物是将CTO189fA/B与CTO189fC以2∶1的 摩尔比混合，下游引物为CTO654r[11]。第1轮PCR反应体系为25μL的 2×TaqPCRMasterMix，1μL的 上游引物，1μL的 下游引物，1μL的 模板，然后用无菌超纯水补足至50μL。第1轮PCR反应体系同上，同时做空白对照。
擴增後PCR産物經瓊脂糖電泳檢測片段大小約爲250bp，表明PCR擴增成功，可進行後續DGGE電泳分析。
1：4 氨氧化菌16SrDNA片段的 DGGE分析
实验采用C：B：S： SCIENTIFIC 公司DGGE-2001系统对PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分离，完毕后将凝胶进行硝酸银染色，碳酸钠显影，并将像在观测仪中进行拍照存档。石英砂为使污水达到排入某一水体或再次使用的水质要求对其进行净化的过程。
1：5 目的 条带的 克隆与测序
选取DGGE上明显的 条带用灭菌刀切取并置于1：5mL的 灭菌离心管中，加入50μL已灭菌的 超纯水，在60~100℃下水浴20min;取出离心管置于4℃冰箱中静置过夜，待DNA片段从胶中缓慢浸出。J9九游会官网地表水污染显而易见，地下水的污染却是触目惊心。中国13亿人口中，有70%饮用地下水，660多个城市中有400多个城市以地下水为饮用水源。但是据介绍，全国90%的城市地下水已受到污染。将离心管在5000r/min下离心5min，取6μL浸出液为模板进行PCR扩增。
将PCR扩增产物置于1：5% 琼脂糖凝胶中检测，若电泳结果较好，则将PCR产物送至天津华大基因技术有限公司进行DNA常规测序。
1：6 DGGE谱的 生物多样性及相似性分析
通过应用Bio-Rad公司的 凝胶分析软件Quanti-tyOne对扫描所得DGGE谱中氨氧化（oxidation)菌条带的 强度进行分析，将每个条带的 强度转化为峰面积值输出，并采用Shannon-Wiener多样性指数计算公式进行计算。对微生物群落内微生物菌种的 多样性进行评价。利用戴斯系数讨论氨氧化菌群的 相似性。同时根据DGGE条带分布的 相似程度构建标准泳道比较和族群归属系统树状。
多樣性指數H計算公式爲:
式中:Pi=ni/N，其中ni为条带i的 峰面积，N为所有峰的 总面积。
戴斯系數計算公式爲:
式中:j为泳道A和B共有条带，a和b分别为样品A和B中各自的 条带数。
以游泳馆污水为处理对象的 ＳＢＲ中不同污泥负荷下氨氧化菌群落的 演变